Микробиологическое обоснование заместительной сурфактантной терапии туберкулеза отечественными препаратами сурфактанта

УДК 616.24-002.5:612.212.014.1:579

В.А Ивашковский, А.К Загорулько, Н.А Хаблученко, И.В Знаковская

Наиболее эффективным путём восстановления сурфактантной системы лёгкого является заместительная терапия препаратами экзогенных сурфактантов.

Целью настоящего исследования явилось микробиологическое обоснование заместительной сурфактантной терапии туберкулёза лёгких отечественным препаратом “Сузакрин” (регистрационный № UA/5005/01/01) и его производного препарата БАЗК (бронхоальвеолярный защитный комплекс), содержащего в своем составе в отличие от «Сузакрина» сурфактант-ассоциированный белок SP-A и такие важные компоненты системы местной защиты легких, как IgA, IgG и другие. Препарат БАЗК находится в стадии доклинического изучения..

Наш скромный опыт лабораторных исследований не может служить образцом доказательной медицины и, тем не менее, полученные данные позволяют высказать своё мнение, которым мы хотели бы поделиться с коллегами.

Материал и методы исследования: 1. С целью определения туберкулостатических свойств препарата экзогенного сурфактанта “Сузакрин” и его сочетания со стандартными противотуберкулёзными препаратами (ПТП), in vitro проведены исследования мокроты 20 пациентов, страдающих разными формами туберкулёза, по унифицированной методике бактериологического обследования. Патологический материал (мокрота больных) обрабатывался щёлочью согласно приказу МЗ СССР № 558 от 08.06. 1978 г. для быстрого растворения белковых частиц и высвобождения микобактерий туберкулёза (МБТ).

Принцип обработки:  В склянку с бусами помещали исследуемый материал, добавляли двойной объём 4% NAOH с 0,02% бромтимолового синего (несколько капель до появления слабо-синего окрашивания) хорошо смешивали и помещали в термостат на 20 минут. В течение этого времени материал перемешивали несколько раз, добиваясь полной гомогенизации. Гомогенат нейтрализовали 9% и 4% HCL  до замены синей окраски   зелёно-жёлтой. Затем материал центрифугировали 10 минут на скорости 3000 об/мин, осадок ресуспензировали в 1 мл физиологического раствора и засевали на среды Левенштейна-Иенсена и Финна II. Выросшую культуру подвергали микроскопическому исследованию, затем определяли чувствительность культуры МБТ к ПТП и к “Сузакрину”. Для этого использован “метод абсолютных концентраций на плотных средах”. В качестве плотной питательной среды была использована среда Левенштейна – Иенсена, не содержащая крахмала, т.к. крахмал абсорбирует лекарственные препараты. В эту среду до свёртывания добавлялись стандартные концентрации ПТП с различными концентрациями препарата естественного сурфактанта “Сузакрин”, а так же, сочетание 0,1% “Сузакрина” c  различными концентрациями ПТП. Полученные среды разливали в пробирки по 3 -5 мл и сохраняли в наклонном положении в течение 45 минут при 85º С. Приготовленную и стандартизированную по бактериальному стандарту мутности (500 млн микробных тел в 1 мл – 5 ед.) суспензию культуры микобактерий больного засевали по 0,2 мл в каждую пробирку на среды, содержащие эти препараты, а так же, в 1 контрольную пробирку со средой, не содержащей ПТП, после чего пробирки парафинировали и размещали в наклонном положении камеры термостата при 37ºС. Результаты оценивали через 3 недели после засева.

2.Независимо от вышеприведенного опыта, мы по приведенной выше методике выполнили посевы культур МБТ 7 пациентов с выраженной полирезистентностью микобактерий туберкулёза к антибактериальным препаратам. Посевы культуры МБТ на среды, содержащие от 1(50мг) дозы до 5(250 мг). 4 посева на среде с 50 мг, 4 – со 100, 4 – 150 мг, 4 – 200 и 4 с 250 мг. Результаты оценивались в те же сроки.

3. Исследования действия БАЗК на микобактерию туберкулеза были проведены в Киевском НИИ туберкулёза и пульмонологии им. Ф.Г. Яновского.

Согласно протокола были получены флаконы по 8мл эмульсии, которые содержали 480 мг активного вещества (480 мг: 8 мл = 60 мг/мл)

Была изготовлена питательная среда зК Левенштейна-Йенсена с серийным разведением рифампицина и изониазида раздельно, а не в смеси.

Для этого сначала готовили разведения рифампицина следующим путем: в стерильную ступку насыпали содержимое одной капсулы рифампицина (150мг), добавляли 2 мл этилового спирта, тщательно растирали пестиком, добавляли 48 мл стерильной дистиллированной воды: 150 мг:50 мл = 3мг/мл (3000 мкг/мл).

Разводили в 10 раз, потом ещё в 10 раз:

Готовили среду Левенштейна-Енсена. До свертывания разливали его по 5 мл в ряд пробирок. В I-ю пробирку вносили 5 мл разведения из II-ой пробирки, то есть 30 мкг/мл (развели дважды), далее – ряд серийных разведений рифампицина в питательной среде до 0,06 мкг/мл.

На торсионных весах взвешивали 100 мг чистой субстанции изониазида, высыпали в стерильную пробирку, добавляли 2 мл спирта + 8 мл дистилированной воды.

III пробирка: 1 мл (из другой пр-ки) + 9 мл воды = (100 мкг/мл

IV пробирка: 1мл (из третьей пр-ки) + 9 мл воды = 10 мкг/мл

В I пробирку с 9,5 мл среды Левенштейна – Енсена (до свертывания) вносили 0,5 мл. разведения из IV пробирки, то есть 5 мкг: 10 мл = 0,5 мкг/мл.

Далее ряд серийних разведений в пробирках, разлитых по 5 мл – до 0,07 мкг/мл.

Соответствующим образом готовили 3 ряда разведений с рифампицином и 3 ряда с изониазидом.

Свертывали среду с препаратами (в контрольные пробирки препараты не вносили) на протяжении 20 мин. При tº- 85ºC/

Готовили бактериальную суспензию МБТ (лабораторный штамм H37 Rv) содержащий 1·106 микробных тел в 1 мл, развели в 10 раз = 100.000 микробних тел в 1 мл.

Свернутую среду с препаратами распределяли на 3 штатива, в каждом из которых был ряд пробирок, содержащих серийные разведения рифампицина и другой ряд – пробирки с серийными разведениями изониазида (контроль –пробирки со средой Левенштейна –Енсена без БАЗК)

В первый штатив засевали в каждую пробирку по 0,1 мл суспензии, содержащей 100,000 микробных тел, то есть засеяли по 10.000 микробных тел.

В другой штатив засевали в каждую пробирку по 0,2 мл этой суспензии, к которой предварительно добавили в равном количестве БАЗК и выдержали 2-часовый контакт, то есть микобактерий в каждую пробирку засевали столько же, как и в первый штатив, то есть 10.000 микробных тел.

В третий штатив засевали также по 0,2 мл. суспензии наполовину разведенной БАЗК, но после 3- часового контакта с ним.

Контроль – среда без препаратов, микробная взвесь – после 2-х и 3-х часового контакта с БАЗК.

Все исследования повторены дважды, после получения результата первого исследования.

Пробирки с засеянными микобактериями помещали в термостат на 3 недели (tº-37ºC)- до появления хорошо выраженного роста в контроле (без препаратов и без БАЗК)”

Чувствительность микобактерий туберкулёза к антибактериальным препаратам определяется минимальной концентрацией препарата, задерживающего рост микобактерий при стандартных условиях постановки опыта. Культура МБТ считается чувствительной к препарату, если в пробирке со средой, содержащей препарат, нет роста. Если на среде выросло менее 20 колоний при обильном росте в контрольной среде, культуру расценивают, как малочувствительную, а при наличии более 20 колоний – как устойчивую к той концентрации препарата, которая находится в среде.

Используя эти критерии, мы получили следующие результаты:

- на средах с содержанием “Сузакрина”  в концентрации 50 мг (3-5 мл среды) рост микобактерий во всех случаях был обильный, т.е. культура оказалась устойчивой к этой концентрации сурфактанта;

- на средах с концентрацией “Сузакрина” от 100 до 150 мг (2-3 дозы в 3-5мл среды:

а) в 33% случаев микобактерии туберкулёза оказались чувствительными к данной дозе сурфактанта;

б) в 50% число колоний насчитывало менее 20, что было расценено, как малочувствительность к этой дозе препарата;

в) в 17% рост микобактерий был обильным, это свидетельствовало о полной устойчивости МБТ к указанной дозе “Сузакрина”.

- в пробирках, содержащих 200, 250 мг “Сузакрина” (4-5 доз в 3-5 мл среды лишь в одном случае из всех исследуемых отметили скудный рост МБТ. В остальных пробирках рост колоний микобактерий отсутствовал, что нами расценено как чувствительность МБТ к экзогенному сурфактанту.

Неоднозначные результаты получены при оценке чувствительности МБТ к сочетанию 0,1% “Сузакрина” в сочетании с различными ПТП по сравнению со стандартным набором противотуберкулёзных препаратов:

а) лишь в 10% исследований сочетание ПТП с “Сузакрином” не повлияло на чувствительность культуры МБТ к указанным препаратам. Сочетание некоторых антибактериальных препаратов с 0,1% “Сузакрина” приводило к понижению чувствительности к ним МБТ и в 17,66% таким препаратом был стрептомицин;

б) в 2/3 из случаев с понижением чувствительности культура МБТ, чувствительная к 50мкг/мл стрептомицина, стала малочувствительной к сочетанию этой же дозы стрептомицина и 0,1% “Сузакрина”;

в) в 1/3 подобных случаев чувствительная к различной концентрации стрептомицина, культура МБТ стала устойчивой к исследуемому сочетанию препаратов. Было отмечено снижение чувствительности к изониазиду у 5,8%, к канамицину -11,76%.. Малочувствительные к рифампицину микобактерии у 11,66% стали устойчивыми.

В большинстве случаев сочетание ПТП с 0,1% Сузакрина дало положительный эффект – повышение чувствительности к рифампицину у 17,66%, причём в 1/3 анализов от малочувствительности до чувствительности и в 2/3 – от полной устойчивости до чувствительности.

В 11,76% отмечено повышение чувствительности к этионамиду, причём, в ряде случаев исходной была резистентность. У 5,88% стала определяться чувствительность к пиразинамиду и у 5,88% - к изониазиду в максимальной концентрации (25мкг/мл). Аналогичные данные повышения чувствительности к этамбутолу и к канамицину. От полной резистентности к чистым ПТП до чувствительности к ним же в сочетании их с 0,1% “Сузакрина”

Приведенные выше результаты иллюстрированы в таблице:.

Примечание: За 100% взято число любых изменений чувствительности МБТ на фоне использования сочетания ПТП с 0,1% “Сузакрином”

Концентрация “Сузакрина” – 3 мг в каждой пробирке (1мг/мл)

Принятые сокращения:

чув.- чувствительность культуры МБТ к антибактериальным препаратам.

Таблица свидетельствует, что повышения чувствительности МБТ не отмечается только в сочетании 0,1%” Сузакрина” со стрептомицином. Но при сочетании с другими препаратами в большинстве случаев отмечалось повышение чувствительности к антибактериальным препаратам, причём в основной массе (29,4%) наблюдался переход от устойчивости к препарату к чувствительности к нему в присутствии “Сузакрина”. Интересно, что в ряде случаев, сочетание 0,1% “Сузакрина” с антибактериальными препаратами приводило к некоторому снижению чувствительности микобактерий к 1-2 препаратам, при повышении чувствительности к другим препаратам даже в большей степени.

Результаты исследований 2 опыта показали, что в посевах на среды, содержащие 50 мг сурфактанта наблюдался рост микобактерий туберкулёза во всех 4 посевах. При повышении концентрации “Сузакрина”  в питательной среде до 100 мг ситуация существенно не изменилась. При повышении дозировки Сузакрина до 3 доз – (150 мг) микобактерия выросла в 2 анализах и в двух – наблюдался скудный рост культуры МБТ. На средах с содержанием сузакрина в дозе 200 мг лишь в одном случае наблюдался скудный рост МБТ, в 3-х остальных посевах роста МБТ не было. В 4 посевах с максимальным содержанием препарата (250 мг) МБТ не выросли.

Согласно протокола Киевского НИИ туберкулёза и пульмонологии им. Ф.Г Яновского при исследовании БАЗК получены следующие результаты:

Минимальная ингибирующая концентрация (МИK) рифампицина по отношению к  штамму микобактерий туберкулёза (МБТ) H37Rv на плотной среде Левенштейна – Енсена составляет 4 мкг/мл.

После 2 – часового контакта МБТ с БАЗК МИК составила уже 1 мкг/мл, то есть контакт с БАЗК потенцирует действие рифампицина на микобактерии.

После 3- часового контакта МБТ с БАЗК МИК рифампицина была 2 мкг/мл, то есть продолжение контакта БАЗК с микобактериями больше 2 часов не усиливает действие БАЗК.

MИK изониазида на МБТ составляла 0,015 мкг/мл, которая не изменилась даже после 2х и 3х часового контакта МБТ с БАЗК.

Таким образом, несмотря на недостаточное количество лабораторных данных, можно предположить, что:

1. Препарат естесственного экзогенного сурфактанта Сузакрин в терапевтических дозах обладает способностью подавлять рост микобактерий туберкулёза;

2. Сочетание препарата Сузакрин с различными противотуберкулёзными препаратами во многих случаях потенцирует туберкулостатическое действие противотуберкулёзных препаратов;

3. Препарат БАЗК способен потенцировать действие рифампицина на микобактерии туберкулеза.

4. Включение сузакрина других сурфактантсодержащих препаратов (БАЗК) в комплексную противотуберкулёзную терапию может бать показано в качестве препаратов, оказывающих туберкулостиатический эффект самостоятельно и действующих синергически со стандартными противотуберкулёзными средствами.

Литература:

1.Афанасьев Е. О доступности качественных экзогенных сурфактантов в Украине //Здоров’я України.- 2006.- №6(139). –С.50-51;

2.Загорулько А.К.*, Холфелд Й**, Загорулько А.А., Энхорнинг П.*** file://C:\DocumentsandSetting\Рабочий стол\OOO«Докфарм» - Статьи.htm 09022007.

3.Загорулько А.К., Шаланин В.В., Кокорина Е.П. Бронхо-Альвеолярный защитный комплекс. Матеріали науково-практичної школи-семшнару «СУЧАСНІ ПРИНИЦИПИ ІНТЕНСИВНОЇ ТЕРАПІЇ ТА ВИХОДЖУВАННЯ НОВОНАРОДЖЕННИХ».-Судак.- 2005.- С.35-41 147 с.

4.Флорикян А.К. Сурфактантная система лёгких. В кн. “Хирургия повреждений груди” (Избранные лекции).-1998.-Харків.- С.121-140. 509 с.

5.Джансыз. Клинико-морфологическая оценка эффективности заместительной терапии в комплексном лечении острой деструктивной пневмонии у детей: Автореф. дисс. канд. мед. наук.- Киев, 2000.- 20 с.

6.Потапов А.Л. Сурфактантная система лёгких и коррекция её нарушений применением естественного сурфактанта у больных синдромом “острого лёгочного повреждения”: Дисс. На соискание уч. степени канд. мед. наук. – Симферополь.- 2001. – 140 с.

7.Лаборатория центрального НИИ туберкулёза и пульмонологии им. Ф.Г. Яновского. Дослідження дії БАЗК (бронхо-альвеолярного захисного комплексу) на МБТ. Отчёт. – 2006. Киев. – 4 с.

Івашковський В.А., Загорулько О.К., Хаблученко Н.А., Знаковська І.В.

Автори в представленній роботі наводять результати мікробіологічного обгронтування замісної сурфактантної терапії туберкульзу легенів вітчизняним сурфактантом «Сузакрин» (Реестраційний № UA/5005/01/01) Проведено дослыдження мокроти 27 пацієнтів, що страджають різними формами туберкульозу легенів, за уніфікованою методикою бактеріологічного дослідження. Зроблено посіви культур МБТ на середовища, що містять від 50 до 250 мг «Сузакрину», зі стандартнними дозами протитуберкульозних препаратів і без них. Аналогічну роботу проведено в центральному НДІ туберкульозу та пульмонології ім. Ф.Г. Яновського в Киеві.

Автори дійшли висновку, що «Сузакрин» у терапевтичніх дозах (200-250 мг) має здібності пригнічувати зростання МБТ. Включения «Сузакрину» до терапії туберкульозу доцільно як препарату, що надає туберкулостатичного єфекту, і самостійно, і у поєднанні з протиитуберкульозними препаратами.